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              雙熒光素酶報告基因檢測系統——更亮、更快、更準

            產品背景

            雙熒光素酶報告基因常用于啟動子對基因表達影響的研究。將所研究目的基因的調控序列克隆到含有報告基因的表達質粒中,然后將重組質粒導入適當的細胞系,通過測定報告基因表達的水平來間接評價在調控序列指導下啟動子對基因表達的誘導作用。

            熒光素酶是理想的報告基因,因為哺乳動物細胞中不含內源性熒光素酶,轉錄后無需修飾即具有報告基因的功能。

            產品原理

            螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)大小為61KDa,單亞基蛋白,能夠催化熒光素(luciferin)氧化,生成氧化熒光素oxyluciferin;海腎熒光素酶(Renilla luciferase)為36 KDa的單亞基蛋白,能夠催化腔腸素(coelenterazine)氧化形成coelenteramide。二者在翻譯后均無需修飾即可發揮作用。

            通常情況下,海腎熒光素酶作為內腎,用以減少內在因素的某些變化對實驗所造成的影響。

             原理

            該試劑盒先對轉染后的細胞進行裂解,然后以熒光素為底物檢測螢火蟲熒光素酶的活性,之后在淬滅該熒光反應的同時,以腔腸素為底物檢測海腎熒光素酶報告基因的活性;具有檢測信號強、線性范圍廣、無內源活性干擾等特點。

            產品特點

            裂解能力更強:能夠徹底裂解絕大部分種類細胞。

            信號更強:能夠精準檢測弱啟動子的表達。

            靈敏度更高:可檢測低至1020摩爾熒光素酶分子。

            線性范圍更廣:線性檢測范圍超過酶濃度的8個數量級。

            操作流程

            操作流程

            加入海腎熒光素酶反應液的作用1:淬滅螢火蟲熒光素酶的發光  2:加入海腎熒光素酶的底物腔腸素

            產品數據

            檢測試劑和熒光素酶相互作用,可獲得最佳的發光強度

            加入海腎熒光素酶底物后,螢火蟲熒光素發光淬滅情況:基本能夠完全淬滅。

            產品價格

            FAQ

            Q1:雙熒光素酶報告基因最適反應溫度?

            A室溫(20-22)。反應時各個組分(細胞裂解產物,底物工作液等)都需要調整到室溫。此兩種熒光素酶的反應速率是受溫度影響的,為了保證實驗的一致性,我們推薦此兩種工作液在檢測時都孵育至室溫。

            Q2:雙熒光素酶報告基因載體該如何選擇?

            A1)螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3pGL-4或者自己構建的載體

               2海腎熒光素酶建議選取phRL-TKpGL-4載體或者自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動子(如SV40CMV),而選用中等強度的啟動子(如TK)。

            Q3:檢測的熒光數值很低怎么辦?

            A檢測的熒光數值很低說明細胞裂解液中的熒光素酶含量很低。通常解決辦法為

            1)轉染的質粒采用細胞轉染級別的質粒抽提試劑盒抽提。

            2)優化轉染條件,盡可能的提高轉染效率。

            3)增加實驗的細胞量,并且裂解細胞時,適當減少細胞裂解液的量。

            Q4:進行檢測的過程中,熒光信號值太高該如何進行調整?

            A1)在轉染實驗后,減少細胞的孵育時間。

            2)降低熒光信號采集時間。

            3)進行樣品的稀釋。

            Q5螢火蟲熒光素酶讀值和海腎熒光素酶讀值的比例多少時比較合適?

            A盡量保證對照組的螢火蟲熒光素酶的讀值和海腎熒光素酶的讀值接近,或者海腎熒光素酶的讀值比螢火蟲熒光素酶的讀值稍高。對于具體的實驗過程中,由于螢火蟲熒光素酶質粒和海腎熒光素酶的質粒抽提的質量不一致,待檢測目的調控元件的調控能力的不同等原因,一次實驗很難達到一個比較好的實驗結果,因此對于此實驗,我們推薦預實驗優化螢火蟲熒光素酶質粒和海腎熒光素酶質粒的共轉染量。

            Q6:細胞培養、轉染時使用96孔板還是6孔板或者其他規格的細胞培養板?

            A本試劑盒最低檢測限約為10-10 mg/mL 熒光素酶。一般來說,如果能保證10%的轉染效率,96孔板的細胞量就能夠達到實驗要求。如果細胞很難轉染或者待檢測的調控原件的調控作用很弱,可以增加實驗的細胞量。

            Q7:此試劑盒采用何種儀器檢測比較好?

            A能夠檢測化學發光或者生物發光的儀器都可適用于此試劑盒。如果使用多功能酶標儀,為防止各孔之間的干擾,我們推薦使用黑色酶標板,并且不同實驗組之間最好有間隔。

            Q8:螢火蟲熒光素酶反應工作液和海腎熒光素酶反應工作液如何配置,配置之后如何保存?

            A本試劑盒中螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物統一采用50X的包裝形式。分別用相應的緩沖液配置成1X 工作液即可。例如取100 μL50X 螢火蟲熒光素酶底物加入到5 mL螢火蟲熒光素酶緩沖液中,即為螢火蟲熒光素酶反應工作液。

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            規格

            價格(元)

            Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒

            11402ES60/80

            100/1000

            1265/9965

            Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒

            11401ES60/76/80

            100/500/1000

            349/969/1748

             

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            Luciferase Reporter Plasmid negative control熒光素酶報告基因質粒陰性對照

            11555ES03

            1 μg

            938.00

            pGM-CMV Luciferase Reporter Plasmid Positive Control

            pGM-CMV-Luc熒光素酶報告基因質粒陽性對照

            11556ES03

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            pGMLR-TK luciferase reporterpGMLR-TK海腎熒光素酶報告基因質粒)

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            11558ES03

            1 μg

            938.00

             

            螢火蟲熒光素酶報告基因質粒

            NF-κB

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            報告基因慢病毒顆粒

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            GFP報告基因質粒

            NF-κB

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