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              轉座的“移花接木”之功

                  高通量測序(NGS)技術的發展以及實驗通量的不斷增加,要求NGS上游樣本處理步驟盡可能簡便,以提高NGS整個流程的工作效率。轉座系統具有快速“剪切、粘貼”、“復制、粘貼”的功能,已被創新應用于NGS領域,如ATAC-SeqAssay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing,利用高通量測序檢測轉座酶易接近的染色質),LIANTILinear Amplification via Transposon Insertion,通過轉座子的線性放大),單倍體分型,結構變異檢測等,不僅高效簡便,有效縮短NGS樣本建庫時間,實現規模化快速測序,提高測序分辨率,同時能夠被靈活改造,應用于更多的技術創新。

              移花接木——剪切,粘貼

            1. 轉座因子的發現

            20世紀40年代,美國遺傳學家芭芭拉.麥克林托克(Barbara McClintock)在某些玉米籽粒中發現了玉米色素顯現著一些稀奇古怪的模式。她觀察到玉米籽粒顏色的遺傳很不穩定,有時籽粒上還出現一些斑斑點點。通過耐心的記錄和仔細的分析,她發現使籽粒著色的色素基因是在某一特定代上“接上”或“拉斷”的。1951年,在冷泉港生物學專題討論會上,麥克林托克遞交了自己的學術論文,向科學界同行報告了她的新理論,提出遺傳基因可以轉移,能從染色體的一個位置跳到另一個位置,甚至從一條染色體跳到另一條染色體上。她把這種能自發轉移的遺傳基因稱為“轉座因子”,并于1983被授予諾貝爾醫學獎。

            轉座因子的發現改變了人們對基因組序列穩定性的認識。自此以后,人們已經在生物界各個領域證實了轉座子系統的廣泛存在,并將轉座子系統開發成為各種生物基因分析的有效工具之一,極大促進了遺傳學的發展。

              Barbara McClintock

            轉座因子(轉座子)根據其功能是“復制-粘貼”還是“剪切-粘貼”分為I型轉座子和II型轉座子兩類。I型轉座子的轉座中間體是RNAII型轉座中間體是DNAII型轉座子,尤其是來源于細菌的Tn5轉座子,是NGS領域最常用的轉座子。

            2. 轉座子Tn5的轉座事件

            Tn5轉座子是一種細菌轉座子,最早由E. coli中發現,是一段含有若干抗性基因和編碼轉座酶基因的DNA片段(a)。其中IS50RIS50L的序列高度同源,只是IS50L的一個堿基存在突變。IS50具有19bp的倒置末端(外末端outside endOE和內末端inside endIE),兩末端倒置有7個堿基不同。此倒置末端是轉座酶(Tnp)的作用位點。IS50LIS50R均含有編碼轉座酶(TnP)以及轉座阻遏蛋白(lnh)的基因,但由于IS50L中的堿基突變,造成翻譯提前終止,所以僅有IS50R可以產生正常的有活性的TnPlnh

             Tn5轉座子結構

            轉座事件發生時,兩個轉座酶(Tnp)分子(綠色標注)結合到Tn5轉座子的OE末端(黃色標注),形成兩個Tnp-OE復合體,隨后兩個復合體通過TnpC末端相互作用進行聯會,形成一個Tn5轉座復合體,此時Tnp產生切割DNA的活性。隨后Tnp利用切割活性,經過一系列化學反應切除供體DNA,離開供體鏈。當結合到靶DNA上時,Tn5轉座復合體識別并攻擊靶序列(Target site),將轉座子插入到靶序列中,粘性末端通過DNA聚合酶、連接酶作用進行填補,兩端形成9bp正向重復序列。整個轉座過程完成了基因從原始DNA被剪切之后粘貼在另一受體DNA的過程,實現了基因的“跳躍”。

             Tn5轉座機理

            3. 轉座子Tn5用于NGS文庫構建

            NGS文庫構建即把DNA樣本片段化或篩分成指定長度的目標序列,再加上寡核苷酸接頭P5P7(和條形碼Barcode),用于后續測序上機。傳統建庫方式需要經過DNA片段化、末端修復、接頭連接、文庫擴增、多次純化分選等步驟,耗時較長,將Tn5用于測序文庫構建時,可將DNA片段化、末端修復、接頭連接等多步反應轉變為1步反應,極大縮短建庫時間,提高工作效率。

            Tn5用于NGS建庫的體外轉座要素包含:轉座子的末端序列、靶DNA、轉座酶(Tnp)和Mg2+(激活劑),轉座法建庫形成的文庫結構如下:

             轉座法建庫文庫結構

            P5P7端部分接頭序列(Adapter 1/2+轉座子末端序列設計合成供體DNATnp識別轉座子末端形成帶有P5P7端部分接頭的Tn5轉座復合體(見下圖)。該復合體識別受體DNA的靶序列(Target site),切斷受體DNA,并插入攜帶的供體DNA,形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1,一端帶有P7部分接頭Adapter 2DNA,之后通過PCR加上Barcode以及接頭其余部分,形成含P5端與P7端完整接頭的DNA文庫。

             

             

             Tn5轉座系統用于文庫構建

            4. Tn5轉座的前沿應用

            1ATAC-Seq

            ATAC-seq,全稱為Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing,即利用高通量測序檢測轉座酶易接近的染色質)的技術。真核生物的核DNA并不是裸露的,而是有蛋白質即組蛋白與之相結合的。DNA一圈一圈得纏繞在組蛋白上,形成串珠式的結構。而這樣的結構還能夠進一步折疊、濃聚,并在其他架構蛋白的輔助下,形成染色體。當需要進行DNA的復制或者轉錄時,DNA的折疊結構會被打開形成可接近區域,此時,ATAC-seq技術使用Tn5轉座酶進入并切割下暴露的DNA并同時連接上特異性的Adapters,連接上AdaptorsDNA片段被分離出來用于二代測序,從而獲得大量的細胞系和組織樣本基因表達、轉錄調控、轉錄修飾等的信息。相對其他如MNase-seqFAIRE-seqDNase-seq等染色質研究方法來說,ATAC-seq具有快速、樣本需求量少、一次性獲得全基因組上的染色質開放區域等優勢,在表觀遺傳學具有廣闊的發展前景。

             

             ATAC-seq原理

            延伸閱讀:

            [1] Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Transposition of native chromatin for multimodal regulatory analysis and personal epigenomics. Nature methods. 2013;10(12):1213-1218. doi:10.1038/nmeth.2688.

            [2] Buenrostro, JD., Wu, B., Chang, H. Y.&Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-9 (2015).

            [3] Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research, 2017.

            2LIANTI

            LIANTI,全稱為Linear Amplification via Transposon Insertion,即通過轉座子的線性放大,是一項經過改良的單細胞全基因組擴增(whole-genome amplificationWGA)方法。 LIANTI法首先利用Tn5轉座子結合LIANTI序列,形成Tn5轉座復合體(含T7啟動子),之后該復合體隨機插入單細胞基因組DNA,經轉座后,將DNA隨機片段化并連接T7啟動子。隨后T7啟動子行使體外轉錄功能,用轉錄獲得大量線性擴增的轉錄本,轉錄本再經過逆轉錄之后得到大量的擴增產物,隨后進行正常的建庫測序操作。整個過程僅進行線性擴增,沒有進行指數擴增,大大增強了擴增穩定性,降低PCR干擾,此外,該技術將該放法將測量拷貝數的空間分辨率提高了3個數量級(能在千堿基分辨率進行微CNV檢測,基因組覆蓋率可達到97%),助力更有效、更精準地檢測出更多遺傳疾病。

             LIANTI原理

             

            延伸閱讀:

            [1] Chen, C., Xing, D., Tan, L., Li, H., Zhou, G., Huang, L., & Xie, X. S. (2017). Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI). Science, 356(6334), 189-194.

            5. 結語

            轉座參與的普通建庫技術,有效縮短了建庫時間,滿足了測序市場對大規模樣本處理速度的需求,而轉座參與的特定研究方向建庫技術,如ATAC-SeqLIANTICPT-seq等,則更多的滿足了科研人員們對于科學研究的需求。目前轉座子/轉座酶的技術應用在NGS領域還只是冰山一角,相信未來轉座酶/轉座子的可改造性會為NGS提供了更多的可能。

            6. 參考文獻

            Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI).

            ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.

            Transposons Tn10 and Tn5.

            Structure/function insights into Tn5 transposition.

            Transposons: Mobile DNA.

            7. 產品推薦

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