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              【小翊實驗手帳】細胞活力檢測,誰才是王者榮耀

                    每次做MTT實驗,結果一次一個樣,實驗重復性那么差,這樣的實驗數據怎么能發表……

            看到糾結的童鞋,小翊也是深有同感,數據不準確,文章很頭疼,怎么辦?

            不用擔心,師兄最近剛安利了一款新型的細胞增殖和活性檢測試劑CCK-8,可以完全解決實驗重復性差的問題。

            現在讓小翊來評測對比下CCK-8MTT的誰才是王者榮耀~

            原理PK

            CCK-8:WST-8在電子耦合載體1-Methoxy PMS存在的情況下被線粒體內的脫氫酶還原成水溶性的橙黃色甲臜產物(formazan)。通過酶標儀測量細胞液的OD值便可檢測出待測細胞樣品的活性。

               

            CCK-8細胞活性檢測原理圖

            MTT: 是利用活細胞的線粒體脫氫酶在代謝過程中將黃色的可溶性四唑鹽MTT還原為不溶于水的藍紫色產物-甲臜(Formazan)晶體。使用合適的溶解液如DM SO溶解沉積在細胞中的甲臜晶體,通過酶標儀測量細胞液的OD值便可檢測出待測細胞樣品的活性。

             

            MTT胞活性檢測原理圖

            操作流程PK 

             

            CCK-8和MTT操作流程圖

            使用MTT法進行活力檢測時,生成的甲臜產物需要用DMSO溶解,顆粒不完全溶解或者在吸取上清操作過程中帶走部分細胞等情況,往往會導致實驗結果穩定性查、重復性差等一系列問題,有的期刊可能質疑數據的正確性。

            CCK-8生成的甲臜產物是水溶性的,可直接測定OD值,不存在不完全溶解和產物被帶走的情況,可以完全避免MTT法在操作上帶來的誤差。

             

            下面分享幾點小翊師兄進行CCK8細胞活力檢測的經驗。

            1.起始細胞接種數量:以使用標準96孔板為例,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養基)。如果檢測白細胞,靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL 培養基)。

            2.CCK-8加入劑量:一般建議為按培養體系的10%添加,添加過程中應避免產生氣泡。

            3.細胞孵育時間:孵育時間一般為1-4小時,一般懸浮細胞孵育的時間要長于貼壁細胞,由于CCK-8的OD值處在1.0左右是比較好的檢測結果,建議實驗者可以每隔0.5h測定一次OD值,以摸索出最佳孵育時間。

            4.檢測波長:如果沒有450 nm的濾光片,可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片,但是450 nm濾光片的檢測靈敏度最高。

            5.CCK-8對細胞的毒性:CCK-8毒性非常低,檢測完后相同的細胞可以繼續進行其它細胞增殖檢測,如結晶紫染色法、中性紅染色法或DNA熒光染色法等。



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