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              RNA降解對于qPCR實驗的影響到底有多大?(附影響結果)

             

            在完整的RNA和降解的RNA樣本中,檢測的基因的Ct值是穩定的嗎?

            如果基因表達差異倍數不大,與RNA降解有關嗎?

            內參基因的作用:降低RNA降解對qPCR的影響

            引物的選擇:擴增合適大小的目的片段

             

            基因定量包含逆轉錄和定量PCR,獲得高純度、降解程度低的RNA,對于其后的反轉、定量結果,自然是非常重要的。

            一、RNA完整性(RNA integrity

            RNA的降解程度可根據RIN值來評定,該值由Aligent 2100儀器測定。將RNA完整性分為10級,用數字123……8910表示。RIN值越接近10RNA完整性越好;RIN值越接近1RNA降解越嚴重。

             

            就降解程度而言,來源于組織的RNA較細胞嚴重。RNA完整性與樣本的組成(內源性RNase含量)、保存、處理過程(處理難易程度)、處理時間(處理速度)有關。較堅硬、較難處理的樣本(如瘤胃、空腸),獲得的RNARIN值越小,且不同樣本間重復性差。

            二、RNANA發生降解后,qPCR定量的Ct值變大

            Corpus luteum來源的RNA經酶消化處理或紫外線照射,獲得不同降解程度的RNA。之后,對18S rRNA28S rRNAβ-actinIL-1β定量。

            我們可以看到:

            1、不論是高豐度表達基因(18S rRNA28S rRNAβ-actin)或低豐度表達基因(IL-1β),RNA降解程度越高,Ct值越大;RNA完整性越好,Ct值越小。

            2RNA質量越好,Ct值波動越小,qPCR實驗的重復性也越好。

            三、RNA發生降解后,定量結果不可控

            進行基因表達量分析時,可通過選擇內參基因嘗試消除樣本間模板量的差異。RNA的降解可認為是RNA“穩態”的變化,引入內參基因校正樣本不同降解程度的差異。那么經內參(β-actin)校正后的基因(18S rRNA28S rRNAIL-1βqPCR檢測結果即△Ct值變化情況如何呢?

            可以看出:1、內參基因(β-actin)校正后,RNA降解前后,△Ct值變化較Ct值變化小。

            2、經內參基因校正后,對于一些基因(28S rRNA),RNA降解前后,△Ct值依舊會出現“小的”變化。

             

            因此,RNA模板發生降解,利用相對定量PCR可以定量基因表達的趨勢,而進行精確定量需謹慎!因此,基因表達差異倍數不大時,需評估RNA質量。

            四、從RNA完整性角度解釋:qPCR定量,擴增產物長度最好控制在70-250bp

            RNA降解程度與qPCR擴增基因的長度呈現一定的關系:70-250bpRNA完整性越高,Ct值越小,呈現線性關系。而>400bpRNA完整性與Ct值之間無明顯相關性。因此,RNA模板發生部分降解,對于>400bp以上的目的基因,無法利用相對定量進行定性分析。

             

            RNA發生降解,會影響qPCRCt值,導致定量數據的重復性差。即使使用內參基因校正,依舊會造成定量結果出現誤差,不能精確反應樣本間的基因表達量的差異。但是當降解不嚴重時,還是可以用于基因的定性分析。 

            小編碼了這么多字,其實就是想說“作為模板的RNA,它的完整性對于做好qPCR實驗很有意義”,畢竟RNA是容易降解的。

             

            參考文獻

            1.Schroeder A; Mueller O; Stocker S; Salowsky R; Leiber M; Gassmann M; Lightfoot S; Menzel W; Granzow M; Ragg T. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements[J]. Bmc Molecular Biology, 2006, 7(703):3-3.

            2.Fleige S, Walf V, Huch S, et al. Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCR.[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19):1601-1613.

            3.Simone Fleige,Michael W,Pfaffl,et al. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance[J].Molecular Aspects of Medicine,2006,(27) 126139.

            4.Joëlle V, Katleen D P, Steve L, et al. Measurable impact of RNA quality on gene expression results from quantitative PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(9):e63-e63.



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