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              吐血整理外泌體標記大法(附原文獻)

            Exosome(外泌體)是由活細胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡,具有典型的脂質雙分子層結構;參與細胞之間的交流,物質的運輸以及正常生理過程的維持,此外還與疾病的產生有關。
            對分離的外泌體進行體外標記或活體示蹤,有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。目前對于外泌體的標記方法有很多種,包括親脂性的染料和膜滲透型的化合物等。
            下面小編就為大家羅列下近幾年文獻發表中有關外泌體染色的方法。
             
            一、親脂性染料 :PKH-67(green)/PKH-26(red)
            染料可以穩定的與細胞膜脂質區結合并發出熒光,主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究以及體內外的細胞失蹤研究。PKH67的體內熒光半衰期為10-12天。相比于PKH-67,PKH-26具有更長的半衰期,標記在兔紅細胞上的PKH26半衰期長達100天以上。特別適用于體外增殖研究以及長期的體內細胞跟蹤研究。
             
            將PKH67標記的神經細胞外泌體與b.End3 細胞共培養后的熒光圖
            圖片引自:Xu B, Zhang Y, Du X-F, et al. Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity. Cell Research. 2017;27(7):882-897.
             
            二、親脂性羰花青染料(carbocyanine dyes):DiI/DiD/DiO/DiR
            DiI, DiO, DiDDiR是一系列親脂性的熒光染料,可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。這些環境敏感性熒光染料在進入細胞膜之前熒光非常弱,當與細胞膜結合后其熒光強度大大增強。且具有消光系數高、極性依賴性、激發態壽命短等特點。一旦進入細胞膜后,可在整個細胞膜上擴散,最佳濃度時可以使整個細胞膜染色。
            下面小編整理了使用這類染料對外泌體進行標記的文獻。
            DiI
             
            將DiI標記的外泌體注射入小鼠海馬齒狀回(DG)區,分別觀察第3、6和20天的熒光,對比可以發現外泌體在皮質層發生了很大的遷移。
            圖片引自:Zheng T, Pu J, Chen Y, et al. Plasma Exosomes Spread and Cluster Around β-Amyloid Plaques in an Animal Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017;9:12.
            DiD
             
            上圖顯示的是將DiD標記的外泌體與PC12細胞孵育3H后,用共聚焦觀察的結果。
            圖片引自:Tian T, Zhu YL, Zhou YY, Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem. 2014 Aug 8;289(32):22258-67
            DiR
             
            體內靜脈注射DiR標記的外泌體,24H后進行成像觀察,結果如上圖所示。
            圖片引自:Wiklander OP, Nordin JZ, OLoughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.
            DiO
             
            使用ExoChip-chambers捕獲不同樣品中的exosome,然后使用DiO進行外泌體染色,通過觀察熒光的強弱對不同來源樣品中的外泌體進行定量分析。
            圖片引自:Kanwar SS, Dunlay CJ, Simeone DM, Nagrath S. Microfluidic device (ExoChip) for On-Chip isolation, quantification and characterization of circulating exosomes. Lab on a chip. 2014;14(11):1891-1900. 
             
            三、滲透型的化合物標記法:CFSE/CFDA/Calcein-AM
            1、CFSE:
            羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯,常稱為 CFSE,可被動擴散進入細胞。 這種試劑沒有顏色和熒光,直至細胞內的酯酶去除其醋酸鹽基團,產生能發出明亮熒光的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯。 琥珀酰亞胺酯與細胞內氨基反應,形成穩定且能用醛固定劑固定的熒光偶聯物。
             
            使用CFSE進行標記的外泌體可以用于后續FACS、NTA和顯微鏡觀察使用。
            圖片引自:van der Vlist EJ1, Nolte-t Hoen EN, Stoorvogel W, et.al.Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry,Nat Protoc. 2012 Jun 14;7(7):1311-26.
            2、Calcein-AM:
            在傳統的Calcein(鈣黃綠素)基礎上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團,增加了疏水性,使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后,Calcein-AM(本身不發熒光)被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。
             
             
            上圖展示的是通過鈣黃綠素染色的方法對獲得的外泌體完整性進行檢測。如果外泌體完整性很好,發出綠色熒光的鈣黃綠素就可以保留在外泌體中,反之,則會從外泌體中泄漏出來。
             
            圖片引自:Warren D. Gray, Adam J. Mitchell, Charles D. Searles, An accurate, precise method for general labeling of extracellular vesicles, MethodsX. 2015; 2: 360–367.
             
            四、利用外泌體表面的巰基(thiol group)對外泌體進行標記:
            C5-maleimide-Alexa 488 / C5-maleimide-Alexa 633
             
            上圖中左圖顯示的是maleimide-633標記的外泌體與肺成纖維母細胞共培養的結果;右圖展示的是EV488標記的外泌體與Hela細胞共培養的結果。
            圖片引自:Roberts-Dalton HD1, Cocks A, Falcon-Perez JM,et al. Fluorescence labelling of extracellular vesicles using a novel thiol-based strategy for quantitative analysis of cellular delivery and intracellular traffic.Nanoscale. 2017 Sep 21;9(36):13693-13706.
             
            五、通過物理的方法對外泌體進行標記:
            1、放射性標記物:99mTc-HMPAO
             
             
             
                 外泌體標記示意圖:將99mTc-HMPAO與外泌體進行孵育,99mTc-HMPAO進入外泌體后被內源的谷胱甘肽轉換成親水的形式,從而滯留在外泌體中,達到標記的目的。右側是將標記后的外泌體輸入小鼠體內后觀察到的外泌體分布圖。
            圖片引自:Hwang DW, Choi H, Jang SC, et al. Noninvasive imaging of radiolabeled exosome-mimetic nanovesicle using 99mTc-HMPAO. Scientific Reports. 2015;5:15636.
            2、量子點微囊泡標記:Ag2Se @錳量子點
            Ag2Se @錳量子點一體化具有優良的近紅外(NIR)熒光和磁共振(MR)成像能力,可用于MV體內的高分辨率雙模式實時有效的標記跟蹤。是一種低毒高靈敏、非侵入性的實時活體成像的方法。
            Ag2Se @錳量子點是通過控制Mn+與Ag2Se納米晶體在80℃的NaOH溶液反應制成,其具有約1.8納米的超小尺寸,良好的水分散性,高NIR熒光量子產率和12.87毫-1-1高縱向弛豫。超小尺寸使他們能夠通過電穿孔直接和有效地裝入的MV。該方法可以用于不同來源的微囊泡標記,對微囊泡的不會有太多損傷。
             
            上圖展示的是使用Ag2Se @錳量子點對巨型囊泡(MV)進行標記的方法
            圖片引自: Jing-Ya Zhao, Gang Chen, Yi-Ping Gu, et al. Ultrasmall Magnetically Engineered AgSe Quantum Dots for Instant Efficient Labeling and Whole-Body High-Resolution Multimodal Real-Time Tracking of Cell-Derived Microvesicles. Journal of the American Chemical Society 2016 138 (6), 1893-1903
             
             
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            細胞培養上清外泌體快速抽提試劑盒
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            DiI (DiIC18(3)) 細胞膜橙紅色熒光探針
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            25mg
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