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            NGS文库质检方法与注意事项

            ——文库大小、质量、污染物评测

               
               文库的质量对于高通量测序(NGS)产出的数据质量至关重要。过低估计文库的质量,导致Clusters或多重模板太多,数据质量不高;过高估计文库的质量,导致数据读取量少,基因组覆盖率低,所以低估或者高估文库质量都会影响测序效果。

             那么,如?#38395;?#26029;你做出来的文库?#24378;?#20197;用于上机测序的,而不是白费力气建了个没用的文库?或者更糟糕,构建出的文库可以上机测序,但是得到了?#27426;?#27809;有用的数据?

              不要担心,如果你的实验设计精良,你只需要做3步简单的质控就可以判断文库是否合格。

              Bioanalyzer——文库长度检测

             qPCR/Qubit——文库精确定量

            Nanodrop——文库污染物检测

            1. 文库长度检测

            文库长度检测是文库质控的关键步骤。测序上机时,要求文库等摩尔上样(否则可能造成不同文库簇生成密度不同,而影响测序质量),文库的平均长度是计算文库摩尔数的要素之一。

            文库摩尔数(pmol)≈ 文库质量(ng)/ [0.66×文库平均长度(bp]

            Agilent Bioanalyzer是进行文库长度检测最常用的仪器,它基于微控流技术对样本进行分离检测。根据加样要求,在DNA芯片中加入LadderMarkerGelDye以及Sample,当给芯片加入电?#25925;保?#26679;品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳,在样本流动过程中,不同DNA片段根据其大小被分离。同时凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入DNA双链,通过激光激发荧光,使其被仪器检测到,仪器依据收集到的荧光信号强度对样本?#33268;?#23450;量。

            一般情况下,好的文库应该呈现出单一的、?#19981;?#30340;峰,且接近正态分布,长度?#27573;?#22312;150-700bp之间。如下图为使用100 ng E.coli gDNA建库,接头连接后进行双轮分选(0.6×/0.2×和0.55×/0.15×)的检测结果。

            12

               有时,文库?#37096;?#33021;在150-700bp的?#27573;?#20043;外出现杂峰。不同的杂峰大小与峰形可参照以下情况进行分析和实验改进。

            1) 150bp以下出现杂峰

            这种情况可认为是文库扩增时的引物二聚体残留或接头残留导致的,可以通过稍微降低磁珠使用比例重新纯化文库解决。注意,磁珠使用过程中的移液操作,?#24418;?#25200;动磁珠。

            2)在700bp以上出现杂峰

                这种情况可认为是文库扩增循环数过高,出现文库过度扩增自我交联导致的,可以通过文库重新分选解决。

            3)整个文库呈现大小?#27426;?#31216;

               这种情况可认为文库分选操作不良或Input DNA片段化不彻底导致的,可以通过重新进行文库分选或者重新构建文库解决。

            2. 文库浓度检测

            文库质量也是计算文库上机摩尔数的要素。常规使用qPCR法和荧光计法(以Qubit?常用)。

            1)qPCR法

            qPCR法使用特异性引物仅定量样品中两端接头连接完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰,是目前业内进行文库定量的金标准。使用qPCR法时,需要以不同浓度的已知长度的DNA片段(常为452bp)作为标?#35745;方?#34892;标曲制作,进而进行文库定量。

            由于标?#35745;?#19982;文库的?#23548;?#38271;度可能不同,因此计算时,需要对文库质量进行校正。

            原始文库浓度(nM)= [452 bp /文库平均长度(bp)] × 稀释文库的浓度(pM)× 稀释倍数/1000

            一般情况下,理想的文库浓度应在10-100nM之间。如果文库测定结果在100nM以上,表明文库的PCR循环数过高,这可能会增加测序数据中的Duplicate rate,此时可以通过减低1个PCR循环数来获得10-100nM之间的文库。

            为了获得精确的定量结果,在使用qPCR方式进行文库定量时,建议遵循以下原则:

            ?  等量分装qPCR Mix和DNA标?#35745;罰?#36991;免模板污染?#22836;?#22797;冻融的影响

            ?  在进行qPCR之前,将反应体系配制区和模板制?#30422;?#36827;行物理隔离,并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。

            ?  待测样本做梯度稀释,并且同时做3个平行重复

            ?  检查梯度稀释液以及平行样本具有一致性?#30446;?#37325;复的测定值

            ?  检查确定待测文库Ct在标准曲线以内时,使用标准曲线计算文库浓度

            2)荧光计法(Qubit?, Picogreen)

            Qubit?是核酸和蛋白定量荧光仪,采用荧光染料检测特定目标分子的浓度,能?#27426;訢NA和RNA进行精准定量。Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料,其仅在与DNA双链结合后才发出荧光,且所产生的荧光与DNA浓度?#25910;?#27604;,是定量DNA文库的最常用染料。

            https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/Laboratory%20Instruments/Images/1014/sho-qubit-instrument.jpg     https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/ba/PicoGreen_%28topological_formula%29.png/651px-PicoGreen_%28topological_formula%29.png

            由于染料与DNA双链结合,但无法有效区分文库双链和其他不完整双链结构(如单端连接接头产物或未连接接头产物),所以相对qPCR法定量文库来说,Qubit?方法的精确度稍弱一些,但是Qubit?出众的简便性、灵敏度以及低成本使得Qubit?成为测序实验室必备的仪器之一。此外,Input DNA由于没有添加接头,是无法使用qPCR方式定量的,此时Qubit?方法相对其他如Nanodrop等方法来说,是最为精确的方法。

            使用Qubit?荧光计方法得到的文库浓度以ng/μL为单位,而测序上机文库以nM(nmol/L)为单位,因此测定值需要根据以下公式进行换算:

            文库摩尔数(nM)≈ 文库质量(ng/μL)×106/[660×文库平均长度(bp]

            3. 文库污染物检测

            Nanodrop是检测样本污染物最快的方法之一,能够在包括紫外及可见光区域在内的光谱?#27573;?#20869;检测污染物的吸光度信号,核酸污染物的常用参考标准是A260/280和A260/230。

            理想文库的标准是A260/280>1.8,A260/230>2.0,不在该?#27573;?#26102;,建议重新进行文库纯化或者重新建库,否则,可能造成文库簇生成量少,测序数据质量差。

             

            需要注意,不要使用Nanodrop做建库过程中的DNA或RNA定量!

            4. 相关产品

             

            产品名称          

            产品编号

            规格

            价格(元)

            Hieff NGSTM MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina

            12200ES08

            8 libraries

            2456.00

            12200ES24

            24 libraries

            6486.00

            12200ES96

            96 libraries

            23567.00

            Hieff NGSTM DNA selection BeadsSuperior AMPure XP alternative

            12601ES03

            1 mL

            296.00

            12601ES08

            5 mL

            986.00

            12601ES56

            60 mL

            6286.00

            12601ES75

            450 mL

            26186.00

            dsDNA HS Assay Kit for Qubit?

            12640ES60

            100 T

            686.00

            12640ES76

            500 T

            2696.00

            Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina, qPCR Master Mix

            12302ES05

            500 T

            1526.00

            Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina, DNA Standard (1-6)

            12307ES09

            6×96 μL

            2126.00

            Agilent 2100 DNA芯片及配套产品

            http://www.qcbio.com/html/45108.htm

            Agilent 2100 RNA芯片及配套产品

            http://www.qcbio.com/html/45107.htm

             

            ?#35789;OGO

            上海?#35789;?#29983;物科技有限公司

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